雙抗夾心法實驗操作注意事項：

1、樣品稀釋：

（1）稀釋血清避免假陽性的發(fā)生（把蛋白按照一定的倍數(shù)稀釋，如10倍、20倍，將抗原進行稀釋包被反應(yīng)；用稀釋好的陽性參閱血清和陰性參閱血清進行孵育后洗刷，加入酶結(jié)合物進行反應(yīng)，孵育洗滌，加入底物顯色，停止反應(yīng)后分別測定O.D值，O.D值≥1.0的抗原稀釋度為適合的包被濃度。陰性參閱血清O.D值<0.1-0.2。這樣陽性參閱血清和陰性參閱血清的O.D值就會有明顯差別）。

（2）粉末型樣本需要短暫離心，如沾到管蓋、管壁需要將標準品沉入管底；加入蒸餾水時需短暫輕柔渦旋，靜置10-30min，充分溶解。

（3）加水后等待充分溶解后可選擇吸吹或渦旋混勻。

2、試劑平衡：

（1）所有的試劑和樣本需平衡至室溫5-10min，避免產(chǎn)生動力學(xué)反應(yīng)差異這會影響準確性。

3、混勻：

（1）稀釋前、后的樣品需進行搖床充分混勻。

4、加樣操作：

（1）定期校準移液搶。

（2）加樣前需混勻，避免加入到孔壁上，盡可能避免氣泡產(chǎn)生。

（3）避免樣本濺出（可用吸水紙吸取濺出液體）。

（4）避免加樣槍頭反復(fù)吸取導(dǎo)致樣本污染。

（5）加樣操作按照說明書的順序來進行，確保顯色時間一致。

5、孵育：

（1）震蕩孵育，加快抗原抗體之間的相互接觸，使反應(yīng)更加充分。

（2）水浴溫度保持37℃。

（3）水浴需要封閉防止污染。

6、洗板：

（1）洗液盡量不要溢出孔外。

（2）拍過酶標記物后及時更換吸水紙，避免影響實驗的準確性。

（3）手工洗板時拍板要垂直且用力不能過猛，可避免交叉污染。

（4）扣干后的酶標板應(yīng)快速加液，避免干板太久。

（5）采用全自動時需檢查各項水瓶是否充足。

（6）采用全自動時檢查是否堵塞。

7、顯色：

（1）顯色需控制好時間（根據(jù)說明書操作）,時間過短,結(jié)果偏低；時間過長,空白增高/非特異性顯色增加。

（2）顯色呈梯度。

8、比色：

（1）跟換濾光片時注意錯用的可能性。

9、檢測：

（1）酶標儀使用前預(yù)熱10-15min，結(jié)果更穩(wěn)定。

（2）雙波長測定吸光值，可以減少指紋、雜質(zhì)等帶來的誤差（檢測波長450nm-參考波長630nm(570nm)）。