普通pcr引物設(shè)計(jì)和熒光定量pcr引物設(shè)計(jì)的區(qū)別

一、方法不同

1、普通pcr引物設(shè)計(jì)：引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。

2、熒光定量pcr引物設(shè)計(jì)：通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，標(biāo)記跟蹤PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)，利用與之相適應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度

二、原理不同

1、普通pcr引物設(shè)計(jì)：為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。

2、熒光定量pcr引物設(shè)計(jì)：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)熒光信號(hào)不斷累積而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR全程，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，對(duì)全程PCR擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，根據(jù)反應(yīng)時(shí)間和熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。

三、注意事項(xiàng)不同

1、普通pcr引物設(shè)計(jì)：引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物長(zhǎng)度在15~30堿基之間。

3、熒光定量pcr引物設(shè)計(jì)：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀應(yīng)安放在濕度較低、灰塵較少、遠(yuǎn)離水池的平穩(wěn)臺(tái)面上，不能有強(qiáng)光直射，室內(nèi)應(yīng)通風(fēng)良好，無(wú)腐蝕性氣體 。

假陽(yáng)性是指出現(xiàn)的 PCR 擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

產(chǎn)生的原因有：

①引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的序列；

②靶序列太短或引物太短；

③靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。

解決方法有：操作輕柔，防止靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外造成污染；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材高壓消  毒；離心管及加樣槍頭等一次性使用。必要時(shí)，可在加標(biāo)本前，將反應(yīng)管和試劑用紫外光照射，以破壞存在的核酸。