PCR反應(yīng)溫度循環(huán)參數(shù)：

1．變性溫度與時(shí)間

PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)。變性溫度越高，時(shí)間越長(zhǎng)變性就越充分。但溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)又會(huì)影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應(yīng)中第2個(gè)循環(huán)變性重要，需時(shí)間較長(zhǎng)，因模板DNA的鏈比較長(zhǎng)。

2．復(fù)性溫度與時(shí)間

變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好，但是容易出現(xiàn)引物與靶DNA的錯(cuò)配，增加非特異性結(jié)合，溫度太高不利于復(fù)性，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55℃左右。確定了復(fù)性溫度后，復(fù)性時(shí)間并不是關(guān)鍵因素。但復(fù)性時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)增加非特異的復(fù)性。

3．延伸溫度與時(shí)間

引物延伸溫度一般為72℃。這個(gè)溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引物和靶基因的結(jié)合。不合適的延伸溫度不僅會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，也會(huì)影響其產(chǎn)量，72℃時(shí)，核苷酸的合成速度為35-100個(gè)核苷酸/S，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。72℃延伸1min對(duì)于長(zhǎng)達(dá)2kb的擴(kuò)增片段是足夠的。然而，延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)很低濃度底物的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要長(zhǎng)些。

4．循環(huán)數(shù)：

循環(huán)數(shù)決定著擴(kuò)增的產(chǎn)量。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，合適循環(huán)數(shù)取決于靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時(shí)、要增加循環(huán)次數(shù)。另外，酶活性不好，或量不足時(shí)也要增加循環(huán)次數(shù)、以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。